Все выпуски

Как правило, данные конфокальной и многофотонной лазерной сканирующей микроскопии страдают от низкого уровня полезного сигнала и высокого вклада дробового шума, связанного со стохастическим характером испускания фотонов флуорофором. Это осложняет задачу подавления шума и выделения полезного сигнала в таких данных. В настоящее время популярны нейросетевые алгоритмы улучшения изображений, однако они часто представляют собой «черный ящик» и требуют длительного обучения на конкретных наборах данных. В работе предлагается алгоритм подавления шума для данных динамической флуоресцентной микроскопии, опирающийся на наличие пространственно-временных локальных корреляций в полезном сигнале и на отсутствие пространственных корреляций в шумовой компоненте. Сингулярное разложение матриц (SVD), производящее спектральное разложение матрицы ковариации, — распространенный способ низкоранговой аппроксимации двумерных массивов, концентрирующий скоррелированный сигнал в нескольких первых компонентах разложения. Однако данные динамической микроскопии представляют собой трехмерные массивы или тензоры большей размерности, поэтому использование тензорных разложений потенциально может улучшить результат подавления шума по сравнению с обычным SVD. В основе алгоритма — двухэтапное применение усеченного сингулярного разложения высшего порядка (HOSVD) с введением порога для коэффициентов и последующим обратным преобразованием, сначала для локальных трехмерных окон в пространстве TXY (3D-HOSVD), а затем для пространственно объединенных групп трехмерных окон (4D-HOSVD). Для валидации алгоритма используются синтетические данные кальциевой сигнализации в астроцитах, в которых концентрация кальция транслируется в сигнал флуоресценции, значения которого в каждом кадре и каждом пикселе затем служат математическим ожиданием и дисперсией для сэмплирования случайной величины из непрерывного аналога пуассоновского распределения. Проведен анализ чувствительности алгоритма от параметров понижения ранга вдоль размерности временных компонент и группового ранга, длины локального окна и порога коэффициентов разложения. Несмотря на наличие мультипликативного шума, предлагаемый алгоритм демонстрирует значительное улучшение анализируемого сигнала, увеличивая соотношение «сигнал/шум» (PSNR) более чем на 20 дБ. Данный метод не опирается на предположения относительно разреженности или гладкости сигнала и может быть использован в качестве одного из этапов обработки данных динамической флуоресцентной микроскопии для самых различных типов данных.

Fluorescent imaging data are currently widely used in neuroscience and other fields. Genetically encoded sensors, based on fluorescent proteins, provide a wide inventory enabling scientiests to image virtually any process in a living cell and extracellular environment. However, especially due to the need for fast scanning, miniaturization, etc, the imaging data can be severly corrupred with multiplicative heteroscedactic noise, reflecting stochastic nature of photon emission and photomultiplier detectors. Deep learning architectures demonstrate outstanding performance in image segmentation and denoising, however they can require large clean datasets for training, and the actual data transformation is not evident from the network architecture and weight composition. On the other hand, some classical data transforms can provide for similar performance in combination with more clear insight in why and how it works. Here we propose an algorithm for denoising fluorescent dynamical imaging data, which is based on multilinear higher-order singular value decomposition (HOSVD) with optional truncation in rank along each axis and thresholding of the tensor of decomposition coefficients. In parallel, we propose a convenient paradigm for validation of the algorithm performance, based on simulated flurescent data, resulting from biophysical modeling of calcium dynamics in spatially resolved realistic 3D astrocyte templates. This paradigm is convenient in that it allows to vary noise level and its resemblance of the Gaussian noise and that it provides ground truth fluorescent signal that can be used to validate denoising algorithms. The proposed denoising method employs truncated HOSVD twice: first, narrow 3D patches, spanning the whole recording, are processed (local 3D-HOSVD stage), second, 4D groups of 3D patches are collaboratively processed (non-local, 4D-HOSVD stage). The effect of the first pass is twofold: first, a significant part of noise is removed at this stage, second, noise distribution is transformed to be more Gaussian-like due to linear combination of multiple samples in the singular vectors. The effect of the second stage is to further improve SNR. We perform parameter tuning of the second stage to find optimal parameter combination for denoising.

Данная работа посвящена систематическому исследованию равновесных конфигураций кластеров золота и серебра размером от 2 до 9 атомов. Для найденных самых низких по энергии конфигураций проводится расчет электронных спектров возбуждения. Все расчеты проводятся в рамках теории функционала плотности (ТФП) с использованием гибридного функционала B3LYP и псевдопотенциала LANL2DZ. На основании анализа полученных электронных спектров возбуждения делается попытка подтвердить предположение, что небольшие кластеры серебра и золота, способные к люминесценции, могут образовываться только в присутствии стабилизирующей матрицы. Авторы показывают, что без стабилизации в растворе образуются «плоские» и «сферические» конфигурации, спектры которых не соответствуют экспериментальным спектрам возбуждения люминесценции для комплексов «ДНК-кластер».

Present work is dedicated to systematic study of equilibrium configurations of gold and silver clusters in size from 2 to 9 atoms. To the lowest energy configurations is performed calculation of electronic excitation spectra. All calculations are carried out within the framework of density functional theory (DFT) using the hybrid B3LYP functional and ECP LANL2DZ. Based on the analysis of the received electronic excitation spectra we try to confirm the assumption that small gold and silver clusters, capable of luminescence can be produced only in the presence of a stabilizing template. The authors show that without stabilization in the solution formed “flat” and “spherical” configuration whose spectra do not correspond to the experimental luminescence excitation spectra for DNA cluster complexes.

На основании данных по содержанию пигментов фитопланктона, интенсивности флуоресценции проб и некоторыми физико-химическим характеристикам вод Рыбинского водохранилища проведен поиск связи между биологическими и физико-химическими характеристиками. Исследованы стандартные методы статистического анализа (корреляционный, регрессионный), методы описания связи между качественными классами характеристик, основанные на отклонении исследуемого распределения характеристик от независимого распределения. Предложен метод поиска оптимальных границ качественных классов по критерию максимума коэффициентов связи.

Based on contents of phytoplankton pigments, fluorescence samples and some physico-chemical characteristics of the Rybinsk reservoir waters, searching for connections between biological and physicalchemical characteristics is working out. The standard methods of statistical analysis (correlation, regression), methods of description of connection between qualitative classes of characteristics, based on deviation of the studied characteristics distribution from independent distribution, are studied. A method of searching for boundaries of quality classes by criterion of maximum connection coefficient is offered.

В статье представлены результаты экспериментальных и теоретических исследований кинетики проникновения эритрозина в молекулы коллагеназы. Рассматривается случай с введением вещества — флуоресцентного зонда, молекул, которого способны образовывать димеры, в раствор фермента в случае инъекции. Показано, что в молекулы фермента могут проникать как мономеры, так и димеры зонда, образуя комплексы мономер-фермент и димер-фермент. При этом в каждый момент времени происходит трансформация спектра флуоресценции зонда: наблюдается сдвиг максимума спектра и изменение его формы. В то же время иммобилизованные димеры красителя вносят существенный вклад в формирование итогового спектра флуоресценции. Хорошее соответствие экспериментальных и теоретических результатов подтверждает достоверность полученных данных.

The results of the experimental and theoretical researches of kinetics of erythrosine penetration into collagenase molecules have represented in this paper. The case with introduction of the compound (fluorescent probe) which has dimers to enzyme solution as an injection has been considered. It was shown that monomers and dimers can penetrate into enzyme molecules with formation complexes monomer — enzyme, dimer- enzyme. Moreover, transformation of probe fluorescence spectra is at each time moment. Spectrum maximum shift, and its form change. At a time, the immobilized dye dimers greatly impact to formation of end fluorescence spectrum. Well correlation between experimental and theoretical results confirms reality of the obtained data.

Репрессилятором называют первую в синтетической биологии генную регуляторную сеть, искусственно сконструированную в 2000 году. Он представляет собой замкнутую цепь из трех генетических элементов — $lacI$, $\lambda cI$ и $tetR$, — которые имеют естественное происхождение, но в такой комбинации в природе не встречаются. Промотор каждого гена контролирует следующий за ним цистрон по принципу отрицательной обратной связи, подавляя экспрессию соседнего гена. В данной работе впервые рассматривается нелинейная динамика модифицированного репрессилятора, у которого имеются запаздывания по времени во всех звеньях регуляторной цепи. Запаздывание может быть как естественным, т. е. возникать во время транскрипции/трансляции генов в силу многоступенчатого характера этих процессов, так и искусственным, т. е. специально вноситься в работу регуляторной сети с помощью методов синтетической биологии. Предполагается, что регуляция осуществляется протеинами в димерной форме. Рассмотренный репрессилятор имеет еще две важные модификации: расположение на той же плазмиде гена $gfp$, кодирующего флуоресцентный белок, а также наличие в системе накопителя для белка, кодируемого геном $tetR$. В рамках детерминистского описания методом разложения на быстрые и медленные движения получена система нелинейных дифференциальных уравнений с запаздыванием на медленном многообразии. Показано, что при определенных значениях управляющих параметров единственное состояние равновесия теряет устойчивость колебательным образом. Для симметричного репрессилятора, у которого все три гена идентичны, получено аналитическое решение для нейтральной кривой бифуркации Андронова–Хопфа. Для общего случая асимметричного репрессилятора нейтральные кривые построены численно. Показано, что асимметричный репрессилятор является более устойчивым, так как система ориентируется на поведение наиболее стабильного элемента в цепи. Изучены нелинейные динамические режимы, возникающие в репрессиляторе при увеличении надкритических значений управляющих параметров. Кроме предельного цикла, отвечающего поочередным релаксационным пульсациям белковых концентраций элементов, в системе обнаружено существование медленного многообразия, не связанного с этим циклом. Долгоживущий переходный режим, который отвечает многообразию, отражает процесс длительной синхронизации пульсаций в работе отдельных генов. Производится сравнение полученных результатов с известными из литературы экспериментальными данными. Обсуждается место предложенной в работе модели среди других теоретических моделей репрессилятора.

The repressor is the first genetic regulatory network in synthetic biology, which was artificially constructed in 2000. It is a closed network of three genetic elements — $lacI$, $\lambda cI$ and $tetR$, — which have a natural origin, but are not found in nature in such a combination. The promoter of each of the three genes controls the next cistron via the negative feedback, suppressing the expression of the neighboring gene. In this paper, the nonlinear dynamics of a modified repressilator, which has time delays in all parts of the regulatory network, has been studied for the first time. Delay can be both natural, i.e. arises during the transcription/translation of genes due to the multistage nature of these processes, and artificial, i.e. specially to be introduced into the work of the regulatory network using synthetic biology technologies. It is assumed that the regulation is carried out by proteins being in a dimeric form. The considered repressilator has two more important modifications: the location on the same plasmid of the gene $gfp$, which codes for the fluorescent protein, and also the presence in the system of a DNA sponge. In the paper, the nonlinear dynamics has been considered within the framework of the deterministic description. By applying the method of decomposition into fast and slow motions, the set of nonlinear differential equations with delay on a slow manifold has been obtained. It is shown that there exists a single equilibrium state which loses its stability in an oscillatory manner at certain values of the control parameters. For a symmetric repressilator, in which all three genes are identical, an analytical solution for the neutral Andronov–Hopf bifurcation curve has been obtained. For the general case of an asymmetric repressilator, neutral curves are found numerically. It is shown that the asymmetric repressor generally is more stable, since the system is oriented to the behavior of the most stable element in the network. Nonlinear dynamic regimes arising in a repressilator with increase of the parameters are studied in detail. It was found that there exists a limit cycle corresponding to relaxation oscillations of protein concentrations. In addition to the limit cycle, we found the slow manifold not associated with above cycle. This is the long-lived transitional regime, which reflects the process of long-term synchronization of pulsations in the work of individual genes. The obtained results are compared with the experimental data known from the literature. The place of the model proposed in the present work among other theoretical models of the repressilator is discussed.

С помощью комплекса биофизических и математических методов исследовано влияние ионов меди на первичные процессы фотосинтеза пресноводной микроводоросли Scenedesmus quadricauda. Проведена оценка воздействия меди (0,1–10 мкМ CuSO₄) по индукционным кривым флуоресценции хлорофилла a, полученным как на суспензии клеток, так и на отдельных клетках водорослей после инкубации в световых и темных условиях. Установлено, что медь оказывает дозозависимое воздействие на фотосинтетический аппарат микроводорослей. Низкие (0,1 мкМ) концентрации CuSO₄ по ряду параметров оказывают стимулирующие воздействие, тогда как концентрация 10 мкМ приводила к существенным нарушениям функционирования фотосистемы II. Анализ флуоресценции одиночных клеток оказался более чувствительным по сравнению с традиционными измерениями на суспензиях, позволив выявить гетерогенность реакции клеток на действие CuSO₄. Анализ кинетики быстрой флуоресценции хлорофилла a (JIP-тест) показал, что наибольшую чувствительность к воздействию меди проявили параметры $\delta_{Ro}$ и $\varphi_{Ro}$, которые достоверно отличались от контроля при воздействии не только высокой, но и средней концентрации (1 мкМ). При инкубации с CuSO₄ в световых условиях снижение фотохимической активности клеток было менее выражено, чем в условиях темновой инкубации. Нормирование данных по интенсивности начальной и максимальной флуоресценции на оптическую плотность суспензии при $\lambda = 455$ нм значительно повысило чувствительность метода и позволило более точно интерпретировать эти данные. Использование L₁-регуляризации (LASSO) по методу наименьших углов (LARS) для спектральной мультиэкспоненциальной аппроксимации индукционной кривой позволило выявить ее временные характеристики. Результаты математической обработки полученных данных дают основание предположить, что действие ионов меди приводит к увеличению нефотохимического тушения флуоресценции, являющегося защитным механизмом рассеивания избыточной энергии возбуждения. Наблюдаемая гетерогенность реакций отдельных клеток водорослей на воздействие меди, по-видимому, является важным адаптационным механизмом, позволяющим популяции сохранять жизнеспособность в условиях стресса. Полученные данные подтверждают перспективность использования методов флуоресцентного анализа для ранней диагностики стрессовых воздействий тяжелых металлов на фотосинтезирующие организмы.

The effect of copper ions on the primary processes of photosynthesis in freshwater microalgae Scenedesmus quadricauda was studied using a set of biophysical and mathematical methods. Chlorophyll a fluorescence transients were recorded both in cell suspensions and at the level of single cells after incubation at copper concentrations of 0.1–10 $\mu$M under light and dark conditions. It was found that copper has a dose-dependent effect on the photosynthetic apparatus of microalgae. At low copper concentration (0.1 $\mu$M), a stimulating effect on a number of studied parameters was observed, whereas significant disruption of Photosystem II activity was detected at 10 $\mu$M. The method of analyzing fluorescence of single cells proved to be more sensitive compared to traditional suspension measurements, allowing the detection of heterogeneous cellular responses to the toxicant. Analysis of chlorophyll a fast fluorescence kinetics showed that the JIP-test parameters $\delta_{Ro}$ and $\varphi_{Ro}$ were the most sensitive to copper exposure and were significantly different from the control when exposed not only to high but also to medium (1 $\mu$M) copper concentrations. The decrease in photochemical activity of cells during light incubation was less pronounced compared to dark conditions. The application of data normalization to optical density at $\lambda = 455$ nm significantly increased the sensitivity of the method and accuracy of result interpretation. The use of L₁-regularization (LASSO) by the least angles method (LARS) for the spectral multi-exponential approximation of the fluorescence transients allowed us to reveal their temporal characteristics. Mathematical analysis of the obtained data suggested that copper exposure leads to increased non-photochemical quenching of fluorescence, which serves as a protective mechanism for dissipating excess excitation energy. The revealed heterogeneity of cellular responses to copper action may have important ecological significance, ensuring the survival of part of the population under stress conditions. The obtained data confirm the promise of using fluorescent analysis methods for early diagnosis of heavy metal stress effects on photosynthesizing organisms.

Апробирован метод расчета границ классов качества вод для целей экологической диагностики и нормирования по данным Рыбинского водохранилища. В целях биоиндикации использованы показатели интенсивности флуоресценции фитопланктона и показатели содержания пигментов фитопланктона. Коэффициент существенности Чеснокова оказался наиболее предпочтительной мерой связи для анализа влияния факторов среды на индикаторы. Выявлены существенные для экологического состояния факторы окружающей среды. Проведено сравнение полученных границ классов качества, разделяющих «допустимые» и «недопустимые» значения факторов с границами из других классификаторов качества вод.

Approbation of calculation of borders of water quality classes for the purpose of ecological diagnosis and standardization by data of the Rybinsk reservoir is carried out. For bioindication indicators of phytoplankton fluorescence and the contents of pigments of phytoplankton are used. Chesnokov's importance coefficient proved to be the most preferred measure of connection for analyzing the effects of environmental factors on indicators. The factors important for environmental condition are identified. Comparison of borders between quality classes “valid” and “invalid” of factors values and boundaries of the classifications of water quality.

Проведен теоретический анализ скорости миграции энергии в процессе нефотохимического тушения флуоресценции пигмент-белкового комплекса фикобилисом оранжевым каротиноидпротеином у цианобактерий. Показано, что наблюдаемая скорость переноса энергии не может быть интерпретирована в рамках индуктивно-резонансного механизма миграции энергии (теория Фёрстера). Напротив, согласно проведенным расчетам реализация экситонного механизма полностью соответствует экспериментально наблюдаемой высокой скорости тушения. Существенной особенностью реализации экситонного механизма является соблюдение ряда структурно-функциональных условий, требующих от молекулярной системы тонкой настройки во взаимодействии молекул донора и акцептора как друг с другом, так и с локальным молекулярным окружением.

It was carried out a theoretical analysis of the energy migration rate in the process of non-photochemical quenching of fluorescence pigment-protein complex that performed by means of orange carotenoid-protein in the phycobilisomes of cyanobacteria. It is shown that the observed rate of energy transfer can not be interpreted in the framework of inductive-resonant mechanism of energy migration (Förster’s theory). On the contrary, according to the calculations the implementation of the exciton mechanism is fully consistent with the experimentally observed high quenching rate. An essential feature of the implementation of the exciton mechanism is to comply with a number of structural and functional conditions that require fine-tuning of the molecular system in the interaction of donor and acceptor molecules both each other and with the local molecular environment.

На основании данных по содержанию пигментов фитопланктона, интенсивности флуоресценции проб и некоторым физико-химическим характеристикам вод Рыбинского водохранилища проведен поиск связи между биологическими и физико-химическими характеристиками. Исследованы методы описания связи между качественными классами характеристик, основанные на прогнозе качественных значений одной характеристики по качественным значениям другой. Найдены границы качественных классов исследуемых характеристик.

Based on contents of phytoplankton pigments, fluorescence samples and some physico-chemical characteristics of the Rybinsk reservoir waters, searching for connections between biological and physicalchemical characteristics is working out. The methods of describing of connections between qualitative classes of characteristics, based on forecast of quality values of one characteristics by quality values of another one, are studied. The borders of quality classes of studied characteristics are found.

В статье представлены результаты теоретических исследований диффузии молекулярного зонда в биологической жидкости и её влияние на спектры флуоресценции. Рассматривается случай с введением вещества в биологическую жидкость на примере инъекции. Показано, что смещение спектра флуоресценции введенного зонда относительно его спектра флуоресценции в буферном растворе является результатом диффузионных процессов в биологической жидкости и иммобилизации зонда в содержащиеся в ней структуры (вещества белковой природы, различные виды клеток и прочие).

The results of theoretical researches of molecular probe diffusion as well as its impact to probe fluorescence spectra are represented in this paper. The case with compound introduction to biological liquid as an injection has been considered. Shown, fluorescence spectra shifts of injected probe is a result of diffusion processes in biological liquid as well as its immobilization to contained structures (compound of peptides nature, different cell types and others).